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引物长度多少合适（关于PCR的扩增体系详解）

爱玩数码编辑 • 2023年1月4日 15:34:02 • 投稿 • 阅读 2303

这期讲解PCR的扩增体系。

如果要想成功的完成一次PCR扩增实验，那么就少不了引物、酶、dNTP、模板、Mg2+等基本要素。

引物

首先引物决定了PCR扩增片段的长短，也是PCR扩增特异性的关键；那么要想保证PCR扩增的特异性，引物就一定要与模板DNA具有完全的互补性。如果模板DNA的核苷酸序列是已知，那就能按照其序列设计合成一定长度的互补寡核苷酸链做引物，从而将特定长短的靶DNA在体外扩增。

引物的长度：一般以18~30bq为宜，以20bq左右的较为常用。引物过短，易导致非特异扩增。引物较长的话其特异性虽好，但也易引起二级结构。

引物的G+C的比例和碱基：G+C含量需适宜，在40%~60%为宜；G+C比例太高容易出现非特异条带；太低，扩增效果不佳。ATGC四个碱基随机分布比较好。

引物的熔解温度（TM）：与长度、序列组成和浓度有关。理想的TM在55~60℃。TM对PCR扩增的特异性影响较大。TM较高时：扩增效率会降低，甚至不出现扩增；TM过低：可能出现错误的扩增引导。

引物的量：每条引物的的浓度不易过高，较低的引物浓度比较理想；引物浓度偏高易导致错配和非特异扩增。

酶

用于PCR的耐热DNA聚合酶可分两类，一类是从水生嗜热菌中纯化的TapDNA聚合酶；一类是通过基因工程在大肠埃希菌中表达的酶。酶的浓度过高可导致非特异扩增；过低则扩增效率减低，产物减少。

dNTP

dNTP是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四个的总称，N代表其中一个。原料一般为颗粒状粉末，应在适当条件下保存。dNTP溶液呈酸性，是由dNTP粉末配置而成。4种dNTP浓度必须是等摩尔的。任何一种偏高或偏低都会引起错配。

模板

模板的量与纯度也是PCR扩增成功与否的关键，一个PCR反应管内应该至少有一分子模板DNA；靶核酸通常是提取体液和组织标本中的细胞DNA。标本中一般含有大量对PCR有抑制作用的蛋白质和脂质等物质；通常采用SDS和蛋白酶K来处理标本；SDS是一种对人体有微毒的阴离子表面活化剂，主要作用是溶解细胞膜上的脂质与蛋白质，进而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白。蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的蛋白质。RNA一般是采用异流氰酸胍或蛋白酶K法，可以防止RNase降解RNA。

Mg2+

Mg2+是Taq的DNA聚合酶不可缺少的辅助因子，不但影响PCR扩增效率，也影响扩增的特异性。Mg2+过高，酶活性增强，易出现非特异扩增，反应的特异性将减低；Mg2+过低，则会降低酶的活性，使扩增产物减少。

当然，除了这五个基本的要素因子，还有PCR的扩增参数等等。